蛋白质组学系列四——蛋白质组学质谱的数据采集方法

1.DDA 技术

DDA（Data-dependent acquisition）即数据依赖型扫描模式，是最早和最简单的质谱数据采集模式，主要用于以采样和发现蛋白质为主要目标的蛋白质组学的研究中。其扫描的方式是将一级质谱信号最强的Top20的多肽进行二级打碎，然后进入二级质谱进行检测。其优势是二级谱图采集的肽段信息都来源于同一条多肽，有利于后续的定性分析，但这种采集方式会忽略一些肽段的信息。而且对于大样本量的组学实验，也存在一定的通量限制。那么有没有一种技术可以解决目前蛋白组学困局呢？

对于组学数据的验证，常规的方法有：PCR、RT-PCR、WB技术、Elisa技术等，但是对于蛋白组学的验证，RNA水平的验证显然不能满足科研工作者的要求；WB技术和Elisa技术虽然在某种程度上解决了不同组学之间的尴尬，但是由于抗体的定制难度，在非模式物种中的应用一直没得到解决。在这样的一个基础上，DIA、PRM技术隆重登场。

2.DIA 技术 

DIA（Data-independent acquisition）即数据非依赖型采集模式，是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库，之后采用DIA方法进行质谱数据采集，从而实现对样品中蛋白质的定性及定量，不同于传统的DDA技术，DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。

 图2.DIA（数据非依赖采集）

DDA模式对肽段离子的选择具有限制性和随机性，存在较多的数据信息缺失，而DIA模式的目标则是获得完整的数据，实现蛋白质的深度覆盖和精准定量。此外在复杂样品中，二级信号的定量比一级信号更为灵敏（例如一级质谱信号可能存在相似质荷比离子的干扰）。DDA模式为一级质谱信号定量，而DIA模式为二级质谱信号定量，因此DIA模式的定量准确性和重现性都更好。

DDA模式下肽段分子和其二级碎片离子有着对应关系，通过对已知数据库的搜索匹配，即可得到样本中的肽段及相关蛋白质信息。而DIA模式下肽段离子与其碎片离子之间的直接关系丢失（DIA光谱中的碎片离子可能是由多个肽段离子组成），复杂的谱图仍然给后续的数据分析和统计学检验带来很多挑战。对此目前已有多个团队开发出DIA分析的软件，例如OpenSWATH和Skyline，这些软件通过建立样本的参考库，对色谱峰进行抽提并分析。此外也有研发团队提出不需要参考库的数据分析方法DIA-Umpire，通过对肽段离子和碎片离子的匹配合成产生虚拟谱图进而搜库分析。因此，DIA技术非常适合一次性获取数百上千种蛋白质更为全面信息（高覆盖率，高准确度，高重复性）的研究。

3.PRM技术

PRM（Parallel Reaction Monitoring,平行反应监测) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量。PRM技术基于Q-Orbitrap为代表的高分辨、高精度质谱平台（MRM技术基于SCIEX Triple Tof 系列质谱，以SCIEX-5600为代表），首先利用四级杆质量分析器的选择能力，用Q1选择目标肽段的母离子，随后在collision cell 中对母离子进行碎裂， 最后利用Orbitrap分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

 图3.PRM（平行反应检测）